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      壓電石英晶體免疫傳感器在前列腺特異抗原檢測的實驗研究


      www.elainecharton.com 2008年3月28日

              [摘要]  目的  構建一種檢測前列腺特異抗原(PSA)的新型壓電石英晶體免疫傳感器。
          方法 采用AT切型、基頻10 MHz的金膜電極石英晶體用金屬夾具和乳膠套圈固定形成檢測池,抗人nA單克隆抗體采用巰基化方法固定在金膜電極表面制成抗體識別膜,構成壓電PSA免疫傳感器,同時對56例臨床血清標本進行檢測,并與化學發光免疫分析法進行比較。
          結果  構建的壓電PSA免疫傳感器對PSA的響應特性良好,其線性檢測范圍為1.25-50n9/ml,批內、批間變異系數(CV)分別小于4.0%和6.0%,與化學發光免疫分析法具有良好的相關性(r=0.95,P>0.05),癌胚抗原(CEA)、甲種胎兒球蛋白(AFP)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)等對PSA的檢測基本無干擾;傳感器可再生后重復使用5次。
          結論  壓電PSA免疫傳感器具有靈敏度高、特異性好、不需標記、操作簡單、省時、能實時在線檢測和重復使用等優點,是一種檢測PSA的新方法,適用于臨床檢測,有推廣價值。

          免疫測定前列腺特異抗原(prostate speciflc antigen,PSA)是一種僅由前列腺管上皮細胞產生和分泌的前列腺特異性標志物,在前列腺腫瘤、增生時其水平升高,且具有很好的組織特異性。因此,血清PSA的檢測是診斷前列腺腫瘤的最佳方法之一。目前,PSA的臨床檢測方法主要有化學發光免疫分析法、放射免疫分析法、酶聯免疫吸附分析法等。這些方法都需要對抗體或抗原進行熒光標記、同位素標記或酶標記,操作繁瑣,耗時,檢測成本較高。為此,我們以SuUoSaCSinimidyl 6-[3/-(2-pyridyldithio) propionamido)hexanoate(磺基琥珀酰-2-吡啶二硫-3,丙酰氨基6-己酸鹽,Sulfo-LC-SPDP)巰基化固定法制備抗人PSA抗體識別敏感膜,構建了一種新的質量效應型壓電PSA免疫傳感器,并初步應用于臨床標本的檢測,取得了良好的效果。

          材料和方法
          一、材料
          1、儀器與器材:石英晶振采用AT切型,雙面鍍金電極,基頻10MHz的石英晶體,晶振為13.0mm×13.0mm的方片,金膜電極直徑為4.0 mm,晶振兩面電極的接觸點引在晶振的同一面。檢測池固定夾具具有與晶振尺寸相應的固定槽、電極接觸膜及電極導線,上蓋有直徑6.0mm的圓孔,夾具兩端用螺絲固定;池壁為直徑10mm的乳膠套圈。壓電頻率檢測儀采用自激式振蕩電路,頻率信號為TYL電平輸出,檢測室具有恒溫、屏蔽、防震裝置。PCL-836多功能頻率記數卡(臺灣研華公司產品)內置于方正奔Ⅲ型計算機(北大方正集團公司)。自行開發的《PESA2.0頻率采集分析軟件》具有頻率記數、差值顯示、頻率變化趨勢圖顯示等功能。

          2、主要試劑:抗人PSA單克隆抗體購自美國Biodesign公司(濃度為3.0 mg/ml,PBS溶液pH7.0);  Sulfosuccinimidyl6-[3/-(2-pyridyldithio)Provionamido hexanoate(Sulfo-LC-SPDP)為美國
      Pierc。公司產品;化學發光免疫檢測試劑盒為美國Beckman-Coulter公司原裝試劑;人PSA標準品采用化學發光免疫檢測試劑盒的標準品,由西南醫院檢驗科黃君富博士惠贈。其他試劑均為AR級。

          二、方法
          1、石英晶體的預處理:按文獻[7]報道的方法進行。氮氣吹干后備用。
          2、壓電石英晶體傳感器檢測池的組裝:把石英晶振放人金屬夾具的晶振固定槽中,電極接觸點向下放置與外接電極接觸,抗體固定面向上,置人乳膠會圈和帶金屬的固定橡膠條,套上夾具上蓋,旋緊固定螺釘,組裝成壓電石英晶體傳感器檢測池;外接電極與頻率檢測儀檢測接口連接,頻率信號通過PCL-836型數據采集卡進入計算機的頻率采集及分析系統。
          3、抗體的巰基化固定方法:抗體溶液3 1Ll與等體積的Sulfo-LC-SPDP溶液混合,室溫反應60 min,然后加入25 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTr)2ul,混勻后室溫反應30min。上述巰基化抗體混合液全部轉移至石英晶體金膜電極表面,均勻涂布,石英晶體在室溫干燥。分別用0.15 moL/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4)和雙蒸水沖洗3-5次,氮氣吹干,4℃冰箱保存備用。
          4、檢測方法:檢測池置于壓電頻率檢測儀的檢測室內,加入0.15mol/L的PBSl00 ul作為檢測緩沖液,37℃平衡片刻,檢測記錄液相基頻f1;加入10ul不同濃度的PSA標準溶液或血清樣品,繼續檢測60min,記錄頻率f2,頻率偏移值Af:f1-f2。標準曲線每個濃度點重復3次。血清PSA濃度超過50nR/ml時,需稀釋后檢測,共檢測56例臨床標本。

          三、統計學分析:采用SPSSl0.0統計分析軟件進行相關分析。并采用t檢驗和X2檢驗。

          結果
          一、抗體工作濃度的選擇
          為了探討巰基化法固定抗體時抗體的最適工作濃度,把濃度為3.0 mg/m1的抗體稀釋成不同濃度的工作液。觀察抗體濃度與抗體固定量的關系。結果表明,巰基化固定抗體的量與抗體工作濃度密切
      相關?贵w的固定量隨濃度的增加而增大,在抗體濃度達到3.0mg/ml時,抗體的固定量最大。因購買的抗體濃度最高為3.0 mg/ml,無法觀察更高濃度。因此,巰基化法固定PSA抗體,抗體工作濃度選擇3.0 mg/ml,以下實驗均采用這一濃度。

          二、壓電PSA免疫傳感器的響應特性
          1、溫度對傳感器的影響:結果與前文報道一致。在37℃時,抗原抗體反應達到平衡的時間最短,且傳感器的頻率響應最大。當溫度繼續升高時,傳感器的頻率響應卻反而迅速減小,這可能與溫度升高,抗原抗體反應的逆反應速度加快和抗體活性損失有關。
          2、抗原-抗體反應時間對傳感器的影響:用制備好的壓電免疫傳感器檢測PSA標準品,在37℃條件下觀察晶體振蕩頻率隨抗原-抗體反應時間的變化規律。結果顯示,抗原抗體反應在40 min后,頻率達到穩定,繼續檢測,頻率降低已不顯著。表明抗原抗體反應已達到平衡,免疫反應基本完成,再延長反應時間,抗原抗體反應所致的晶體表面質量負載也無明顯變化,頻率達到穩定。因此,實驗選擇40min作為檢測PSA的反應時間。
          3、壓電PSA免疫傳感器檢測方法的特異性:用壓電PSA免疫傳感器檢測人絨毛膜促性腺激素(hCG)、癌胚抗原(CEA)、甲種胎兒球蛋白(AFP)高濃度標準溶液,上述條件反應40min后,檢測hCG、CEA、AFP所致傳感器的非特異性頻率響應值分別為14.4±3.4Hz、2.13±2.9 Hz、10.8±2.2Hz。結果表明,上述物質引起的傳感器頻率響應均在傳感器的噪音范圍內(14.2±3.5 Hz),對PSA的檢測基本無干擾?梢,傳感器的選擇性較好,特異性高,能滿足臨床檢測的要求。
          4、精密度實驗:用Beckman-Coulter公司PSA化學發光免疫分析試劑盒的標準品(高值含PSA 25ng/ml,低值含PSA 5 ns/m1)作為檢測樣品,重復測定20次,高值、低值批內CV分別為2.85%、3.93%;每天上、下午各測定1次,連續10d,得到批間CV分別為4.56%、5.77%。

          三、壓電PSA免疫傳感器檢測標準曲線的制作壓電傳感器在PSA各濃度點的頻率變化值(Af=f1-f2;F1為檢測液相基頻)用3次平行檢測結果的平均值表示,并用參考檢測值進行校正。以PSA標準溶液的濃度為橫坐標,頻率變化的絕對值(Af)為縱坐標作圖,得到PSA壓電免疫傳感器的檢測劑量反應曲線。PSA的濃度在1.25-50ng/ml范圍內,PSA的濃度與傳感器頻率的變化之間呈良好的線性關系,PSA濃度低于1.25 ng/ml時,傳感器頻率的特異性響應信號易被噪聲信號淹沒,因此,1.25 ng/ml是傳感器的最低檢測限。

          四、初步臨床應用利用構建的壓電PSA免疫傳感器(X法)檢測了56例臨床血清標本。同時,采用化學發光免疫分析法(Y法)進行平行檢測,結果經線性相關分析所得散點圖。統計結果顯示,本法檢測結果與化學發光免疫分析法具有良好的相關性(r=0.95,P>0.05)。

          五、壓電PSA免疫傳感器的再生用過的傳感器用8.0 M的尿素再生,再用于PSA檢測,結果表明,傳感器仍有良好的響應特性,但其響應能力呈逐漸下降趨勢。再生5次以后,傳感器的響應能力只相當于第1次的70%,下降非常顯著。因此,認為壓電PSA免疫傳感器可以用尿素再生后重復使用,但再生次數不能多于5次。

          討論
          生物傳感器具有操作簡便、結果準確、檢測快速等特點,因此,近年來獲得了迅速的發展,并廣泛應用于生物醫學、環境監測、食品衛生檢驗等領域。壓電免疫傳感器是一種利用石英晶體作為換能器件,把免疫反應的生物學信號轉換成易于觀察和檢測的頻率電信號的新型傳感檢測技術。其工作的理論基礎是Sauerbrey推導的質量-頻偏方程:Af=-Kjm,通過頻率的變化來反映晶體表面微小的質量改變。
          本研究的壓電PSA免疫傳感器,采用抗PSA的單克隆抗體作為傳感器的免疫識別元件,通過免疫反應捕獲檢測樣品中的PSA,并在石英晶體表面形成抗原抗體復合物,引起石英晶體表面質量負載的微小變化,導致壓電石英晶體傳感器振蕩頻率的下降,通過頻率變化值(叢)來反映樣品中PSA的量。前期研究已發現,密度、黏度、pH和離子濃度是影響壓電石英晶體傳感器液相檢測的主要因素,但血清標本稀釋50%以上,并用0.15mol/L的PBS作為檢測緩沖液,能有效地消除因血清標本加人所致的上述因素的干擾。因此,試驗中加入100,0.15mol/L的PBS緩沖液作為檢測反應溶液,血清標本加入量為10 ul,稀釋10倍左右,基本消除了介質因素的干擾。

          本結果顯示,PSA濃度在1.25-50 ng/m1范圍內,傳感器為PSA有良好的響應能力,檢測靈敏度為1.25ng/ml,與化學發光免疫分析法相當。批內、批間CV分別小于4.0%、6.0%,hCG、CEA、AFP等引起的非特異性頻率響應均在噪聲范圍內,應用傳感器檢測56例臨床標本的結果與化學發光免疫分析法具有良好的相關性(r=0.95)。提示壓電PSA免疫傳感器檢測方法的重復性好、特異性高,能用于PSA的定量檢測。尿素能使結合的抗原抗體復合物解離,重新暴露抗體的抗原結合位點,壓電PSA免疫傳感器用尿素再生后能重復使用5次,降低了檢測成本,大大增加了傳感器的實用性。

          綜上所述,壓電PSA免疫傳感器具有不需標記,操作過程簡便,加入標本后不需加入任何試劑;檢測時間短,僅需40 min左右,比放免法的時間大大縮短;更重要的是避免了繁瑣的標記過程和放免法標記同位素對人體和環境的損害和污染;傳感器能重復使用,與化學發光免疫方法相比,檢測成本低廉等優點。因此,壓電PSA免疫傳感器是一種靈敏、特異、簡便、環保的分析新方法,在臨床PSA檢測方面具有一定的優勢,有望在臨床推廣應用。
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      作者: 張波  府偉靈  毛瓊國  張雪  陳鳴  蔣天倫  俞凡
       
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